Variation in genomischen Bereichen
Inhalt
- Sequenzen finden und herunterladen
- Entfernen von redundanten Sequenzen
- Visualisieren von Sequenzen
Sequenzen finden und herunterladen
Zuerst suche ich alle Sequenzen der Gattung Rheum.Quelle der Sequenzinformationen: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
Dazu wähle ich im DropDown Menü Taxonomy und gebe Rheum im Such Feld ein. Nachdem man die Suche bestätigt hat (ENTER oder Klick auf Search) erscheint – soweit in der Taxonomy Datenbank der Name gefunden wurde – der Treffer "Rheum, genus, eudicot" und zwei Links zu Nucleotid- und Proteinsequenzen. Nachdem man Nucleotide angeklickt hat erhält man eine Liste aller in der Nucleotid Datenbank gespeicherten Sequenzen der Gattung Rheum.
In der Liste tauchen verschiedene Bezeichnungen auf (trnH, psbA, matK), die sich auf unterschiedliche genomische Bereich, Gene bzw. Marker beziehen. Um nun eine Liste aller Sequenzen der Gattung Rheum eines bestimmten Markers zu erhalten, müssen wir die Such-Anfrage anpassen.
Damit suchen wir nach allen Sequenzen der Gattung Rheum (Organismus mit der NCBI Taxonomy ID 3620) die in ihrem Titel den Begriff "matK" enthalten.
An dieser Stelle will ich betonen, dass in vielen Fällen noch mehr gefiltert werden muss, um tatsächlich nur die Sequenzen eines vergleichbaren Bereichs zu erhalten. Z.B. gibt es Sequenzen, die in ihrem Titel "matK" in der Form von "matK-like" enthalten. Wenn man Sequenzen vom matK Gen und einem matK-like Bereich zusammen in einem Aligment anschaut, stellt man fest, dass diese sehr unterschiedlich sind, und zwei verschiedene Marker (genetische Regionen) darstellen.
Ich benutze das Genbank Format und verwende anschließend ein Skript, dass die Art Namen überprüft und Synonyme mit den akzeptierten Namen ersetzt. Zusätzlich wird der Titel der Sequenzen insgesamt verkürzt und dadurch leichter lesbar gemacht.
Titel von Genbank:
gi|728631140|gb|KP058328.1| Rheum coreanum voucher TKM-1-000098 tRNA-His (trnH) gene, partial sequence; trnH-psbA intergenic spacer, complete sequence; and PsbA (psbA) gene, partial cds; chloroplast
Titel nach Konvertierung:
Rheum_coreanum|nPu|UR|Vou|KP058328|psbA-trnH
Zusätzliche Informationen im konvertierten Titel:
nPu = not published (die Sequenz wurde bei Genbank publiziert, ist aber nicht Teil einer publizierten Arbeit)
UR = Laut ThePlantList hat der taxonomische Name "Rheum coreanum" den Status "unresolved", ist also kein offiziell akzeptierter Name
Nachteil:
Das Skript verlässt sich darauf, dass man tatsächlich nur Sequenzen des gewünschten Bereichs heruntergeladen hat. Sollte wie oben erwähnt eine matK-like Sequenz mit dabei sein, würde diese auch unter "matK" geführt werden und möglicherweise zu Verwirrung führen.
Will man die Sequenzen direkt in MEGA oder JalView öffnen, muss man hier das Fasta Format wählen.
Aber nun zurück zum eigentlichen Thema. Wir haben nun von matK (einem kodierenden Bereich) einen Datensatz vorliegen und laden uns noch einen von einem nicht-kodierenden Bereich – einem intergenic Spacer – herunter. Die Suchanfrage verändern wir zu
txid3620[Organism] (psbA-trnH[title] OR trnH-psbA[title])
Damit suchen wir nach allen Rheum Sequenzen die im Titel entweder "psbA-trnH" oder "trnH-psbA" enthalten.
Leider ist es so, das es recht wenige Konventionen gibt, die einem das Leben bei der Suche und der Arbeit mit Sequenzen von Genbank leichter machen würden. Man muss davon ausgehen, dass Sequenzen je nach Lust und Laune entweder in der einen oder anderen Orientierung bei Genbank hinterlegt sind. Wenn man sich den Datensatz dann runter läd muss man die trnH-psbA Sequenzen erst noch umdrehen (reverscomplement), damit man sie mit den psbA-trnH Sequenzen vergleichen kann. Das oben erwähnte Skript ist mittlerweile darauf gefasst und dreht solche Sequenzen automatisch um.
Entfernen von redundanten Sequenzen
Jalview: http://www.jalview.orgIn Jalview kann man die Sequenzen öffnen und redundante Daten entfernen.
Nicht vergessen den Datei-Typ auf Fasta zu stellen, ansonsten werden die Fasta Dateien nicht angezeigt!
Für den aktuellen Vergleich der Sequenzen zweier Marker kann man einfach alle Sequenzen markieren und 100% redundante Sequenzen löschen.
Alle schwarz markierten Sequenzen stellen redundante Information dar und können durch REMOVE entfernt werden. Anschließened speichert man den Datensatz wieder. Wer nicht will, dass JalView die Längenangabe (z.B. /1–422) an die Sequenztitel anhängt kann dies über die Preferences im Haupt-Fenster ändern.
Indem man das Häkchen bei Fasta entfernt, wird in diesem Format der Zusatz "/start-end" nicht angehängt.
Mit JalView lässt sich natürlich mehr anfangen als nur die redundanten Sequenzen zu entfernen. Wir wollen nun die Sequenzen angleichen (to align).
Anschließend – nachdem der Webservice den Auftrag bearbeitet hat – öffnet sich ein neues Fenster mit den angeglichenen Sequenzen.
Visualisieren von Sequenzen
In diesem neuen Fenster wollen wir die Nucleotide etwas einfärben.
Nucleotide klingt vernünftig…
und zeigt die Nucleotide in entsprechend unterschiedlichen Farben…
Identität klingt interessant…
und sieht deutlich anders aus als "Nucleotide". Hier wird nicht zwischen den verschiedenen Nucleotiden sondern zwischen konservierten / identischen Bereichen (dunkel blaue Spalten) und den weniger identischen Bereichen (hellblaue bis weiße Spalten) unterschieden.
Ein weiteres Feature, was vor allem bei großen Alignments sehr hilfreich sein kann, ist das "Overview Window"
Es zeigt das komplette Alignment (derzeit mit der Färbung nach Identität) in einem Fenster an.
Ich will das Thema nun mit einer Frage beenden:
Wenn ihr euch von Rheum das matK und psbA-trnH Alignment nebeneinander im JalView Overview Window anschaut, welches Phänomen tritt im matK Alignment nicht in Erscheinung und warum ?
Liebe Grüße
Thomas
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