Einen Neighbor-Joining Baum erstellen...

Die Erstellung eines Neighbor-Joining Baumes lässt sich in drei Schritte gliedern:

1. Erstellung eines Alignments
2. Berechnung einer Distanz Matrix
3. Erstellung eines Baumes

Alle Punkte können mit Hilfe von MEGA ausgeführt werden. Zur Erstellung des Alignments öffnet man eine entsprechende Sammlung von Sequenzen und lässt diese mit Clustal oder Muscle angleichen. Im Anschluss schaut man sich die Seitenbereiche an und schneidet diese entweder entsprechend zu, oder entfernt extrem kurze Sequenzen und schneidet anschließend zu. Hier muss man abwägen zwischen den Informationen, die verloren gehen wenn man die Ränder zuschneidet, und den Informationen die in einer entsprechend kurzen Sequenz stecken.
Die Schritte 2 und 3 werden von MEGA in einem durchgeführt. Wenn man mit dem Alignment zufrieden ist, exportiert man die Daten für eine phylogenetische Analyse.

Danach wechselt man zum Hauptfenster von MEGA und wählt unter Phylogeny "Construct/Test Neighbor-Joining Tree...".

Im nun offenen Fenster (Analysis Preferences) wählt man die gewünschten Einstellungen zur Berechnung der Distanz Matrix (siehe Phylogentische Analysen - Grundlagen von Bäumen) und definiert wie man die Phylogenie testen will. Zweiteres kann man mit gutem Gewissen mit einem Bootstrap Test (500 Replikate) durchführen.
Durch die Bestätigung der Einstellungen wird die Baumkonstruktion und der Test der Phylogenie gestartet.

Das Ergebnis lässt sich als MEGA Tree-Session speichern, um später weiter zu arbeiten, als Bild exportieren um es in einer Präsentation zu verwenden oder man kann an den Details der Darstellung arbeiten. Mehr dazu in einem anderen Post.

Thomas

Warum erstellen wir phylogenetische Bäume ... und so weiter ?

Im Praktikum geht es bei allen Projekten um...

1. Verwandtschaftliche Beziehungen der verwendeten Pflanzen
2. Unterscheidung der Pflanzen mittels morphologischer und molekularer Marker
3. Unterscheidung verschiedener Produkt Bestandteile

Neben der Morphologie, welche bei Produkten in vielen Fällen nicht für eine Unterscheidung geeignet ist, versuchen wir DNA Marker - bestimmte DNA Bereiche, die es bei allen beteiligten Arten gibt - dafür zu verwenden.

Wir verwenden bioinformatische Hilfsmittel aus zwei Gründen:

DNA Sequenzen im FASTA Format in einem Text Editor

Zum einen lassen sich Sequenzen - und Informationen über diese - in einer informativeren Form darstellen (z.B. farbliche Unterscheidung der Nucleotide).

Jalview und angeglichene DNA Sequenzen

Sliding-Window Ansicht des GC Gehalts von DNA

Zum anderen können Arbeitsschritte, die, wenn man diese manuell durchführen müsste, eine Unmenge an Zeit beanspruchen würden, automatisiert und somit effizienter ausgeführt werden (z.B. die Berechnung einer Distanz Matrix).

Distanz Matrix basierend auf matK Sequenzen von Ocimum

Ein weiterer Aspekt, der insbesondere mit den oben angesprochenen Themen innerhalb der Projekte zutun hat, ist die Visualisierung der Beziehungen der Sequenzen / Pflanzengruppen zueinander. Mit einem phylogenetischen Baum kann man darstellen, welche der Sequenzen näher miteinander verwandt sind (sich ähnlicher sind). Diese bilden sogenannte Cluster welche durch Knotenpunkte mit anderen Clustern verbunden sind.

Neighbor-Joining Bäume von Dracocephalum Sequenzen der Marker ITS2 und psbA-trnH

Eine andere Darstellungsform wäre zum Beispiel eine Principal Component Analyse (PCA), in der die Ähnlichkeiten in eine bestimmte Anzahl (n) an Faktoren zerlegt werden und in einem entsprechenden n-dimensionalen Raum dargestellt werden können.

Eine PCA bzw. MDS einer Ditanz Matrix, basierend auf psbA-trnH Sequenzen von Dracocephalum und anderen Lamiaceae.

Zusammenfassend kann man sagen, dass es bei der Verwendung von bioinformatischen Hilfsmitteln grundsätzlich darum geht, Daten auszuwerten und dabei die Interpretation zu erleichtern.

Ich hoffe das hilft etwas weiter :-)

Grüße
Thomas