Warum man ein Experiment wie etwas Unbekanntes behandeln sollte...

...oder über Reproduktion und Qualität von Experimenten...

Am heutigen Tage kam die Frage auf, warum es nicht ausreicht das Ergebnis einer Gelelektrophorese in einem Bild "mit zufälligen Parametern" festzuhalten.

Das Experiment

Es wurden Schimmel Proben genommen und damit eine PCR (ITS) durchgeführt. Eine der Fragen die wir beantworten wollten war, ob wir ITS ohne DNA zu isolieren amplifizieren können.

Es ist vollkommen richtig, dass wir diese Frage mit einem Gelbild beantworten können, auf dem wir "ITS Banden" sehen. Dabei spielt es keine Rolle mit welchem Zoom oder welcher Belichtung das Foto aufgenommen wurde, solange wir eine Amplifikation erkennen und gleichzeitig die negativ Kontrolle bestätigt, dass die Amplifikation auf der Anwesenheit von DNA basiert, die nicht schon im Mastermix vorhanden war.

Soweit so gut. Kann man noch mehr mit dem Ergebnis anfangen ?

Reproduzierbarkeit

Jedes Experiment bzw. das Ergebnis eines solchen sollte als etwas Unbekanntes behandelt werden. Es kann durchaus sein, dass wir uns zum Zeitpunkt des Experiments nicht über alle Fragen im klaren sind, die wir mit diesem Experiment beantworten wollen bzw. können. Für eine solche Situation, wie auch für diejenige, in der wir tatsächlich nur eine Frage stellen und beantworten können, ist es gute Praxis, wenn man dieses Experiment so durchführt, dass man es reproduzieren kann. Um das zu können benötigt die entsprechende Person alle Parameter des Experiments welche für das Ergebnis verantwortlich sind. Die Dokumentation der Ergebnisse ist dabei ein Punkt wo es eigentlich keine Variation geben sollte. Leider ist es aber so, dass dieser Punkt regelmäßig vernachlässigt wird, und dadurch Ergebnisse nur sehr schwer miteinander vergleichbar sind, bzw. eine Reproduktion nicht möglich ist.

Datenqualität

Neben der Reproduzierbarkeit geht es darum, Ergebnisse mit der höchst möglichen Qualität zu erfassen. Bei Fotos spielt dabei die Auflösung eine wesentliche Rolle. Im Bezug zu den Gel Bildern sollte man versuchen den Platz effizient zu nutzen. Bei doppelten Gelen macht es Sinn, zwei Aufnahmen zu machen. Eins vom oberen und eins vom unteren Teil. Das Ergebnis sind zwei Fotos mit hoher Auflösung statt eins mit reduzierter. Der zusätzliche Aufwand beschränkt sich dabei auf das Verschieben des Blaulichtschirms.

Mehr als nur eine Frage

Im beschriebenen Experiment ging es neben der Frage ob eine Amplifikation möglich ist, auch darum zu sehen, welche Fragment Größen zu beobachten sind, wie stark die Amplifikation jeweils war und ob eventuell mehr als eine Bande pro Probe zu beobachten ist. Solche Fragen lassen sich generell besser beantworten wenn man Daten in hoher Qualität hat.

Fazit

Bald möglichst eine konsistente Dokumentation von Experimenten zu etablieren, ist ein immer wiederkehrender guter Rat. Die Zeit die jeder von uns, ob Student oder Betreuer, investiert, ist am wertvollsten wenn wir etwas damit erreichen. Eine konsistente Dokumentation stellt sicher, dass die Daten ohne große Umstände mit anderen verglichen werden können und somit viel eher dazu beitragen Fortschritt in einem Projekt zu erzeugen.

Zum Schluss noch ein paar...

Beispiele

Zwei 17-Taschen Gele übereinander. Die Höhe ist fast vollständig ausgenutzt.

Ein 17-Taschen Gel. Weder die Höhe noch die Breite sind ausgenutzt. Der Parameter "Lage des Gels" wäre hier: unten abschließend, etwas mehr links als rechts. Schwer zu reproduzieren.

Ein 17-Taschen Gel. Im Gegensatz zum Bild mit zwei Gelen wird bei der Aufnahme eines Gels die volle Breite des Kamera Sensors ausgenutzt. Insgesamt sind die Banden deutlicher zu sehen. Das Ergebnis wird in maximaler Auflösung erfasst und kann mit dem festen Parameter (Ladeschema, 17-Taschen Gel, schließt links und rechts ab) 1:1 reproduziert und verglichen werden.

23-Taschen Gel, Belichtungszeit 1.52 Sekunden

23-Taschen Gel, Belichtungszeit 1 Sekunde

Angenommen bei den beiden Bilder handelt es sich zum einen um das original Experiment und zum anderen um eine Wiederholung. Können wir anhand der beiden Fotos mit Sicherheit sagen, dass das Experiment erfolgreich wiederholt wurde ?
Angenommen bei den beiden Bildern handelt es sich zum einen um das 1. Experiment und zum anderen um ein modifiziertes Experiment. Können wir anhand der beiden Fotos mit Sicherheit sagen, dass die Modifikation einen bestimmten Effekt hatte ?

In beiden Situationen ist es schwer bis unmöglich eine klare Aussage zu den Fragen zu treffen. Wenn wir ein Experiment wiederholen, dann sollten ALLE Parameter gleich sein. Auch die der Daten Dokumentation. Vor allem wenn wir mit PCR Konditionen experimentieren, sollte neben dem Parameter den wir gezielt testen, kein anderer für Variation des Ergebnis sorgen. Daraus folgt, dass wir in diesen Situationen bei der Dokumentation die Belichtungszeit entsprechend unverändert verwenden.

Es gibt noch viele andere Faktoren, die selbst nichts mit der Dokumentation zu tun haben, aber ebenso zu unerwünschten Variationen in einem Experiment führen. Je früher wir lernen, welche Faktoren das sind, um so früher können wir verhindern, dass diese die Ergebnisse unserer Experimente beeinflussen. Erst anschließend können wir die eigentlichen Fragen beantworten.

Grüße
Thomas